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英文原题：Thermoplasmonic-Assisted Cyclic Cleavage Amplification for Self-Validating Plasmonic Detection of SARS-CoV-2
通讯作者：Jing Wang, ETH Zurich；Gerd A. Kullak-Ublick, University Hospital Zurich
作者：Guangyu Qiu] Zhibo Gai, Lanja Saleh, Jiukai Tang, Ting Gui, Gerd A. Kullak-Ublick, and Jing Wang
在过去的一年中，由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2，以下简称“新冠病毒”）引起的疫情已经渗透到全球每个人口稠密的地区。截至2021年3月19日，这种持续的大流行在全球范围内已导致超过1.2亿例感染病例和267万例死亡。在全民接种疫苗之前，病毒快速检测仍然是减轻疫情传播的最有效方法之一。高性能检测方法不仅可以在感染筛查中快速确定疑似感染患者，也可以利用辅助的样本收集装置进行环境病毒监测，以便及时提醒有关病毒的出现。目前，聚合酶链式反应（PCR）通过核酸“扩增”的原理能够检测到极少量的病毒。并已在临床新冠诊断中被视为“金标准”。但因其对仪器和检测时间的需求较高而较少应用在即时检测中（POCT）。而目前的新型生物传感器大多依赖病毒蛋白和核酸的结合进行“无扩增”的直接快速检测。因此，对于病毒含量较低的样品会出现假阴性信号。
图1. 双模式光热辅助病毒检测流程图
为了弥补现有方法的不足，苏黎世联邦理工学院Jing Wang教授团队与苏黎世大学医院Gerd A. Kullak-Ublick教授团队合作提出了一种表面等离子体光热辅助的双模式传感概念（图1）。其中，传感器通过核酸杂交的方法对样品首先进行初步的无扩增检测。借助等离子体共振光热技术，二维纳米金颗粒矩阵（AuNI）可为核酸杂交提供特定的温度，以确保杂交的准确性。此直接核酸杂交检测的检出限（LOD）可以达到0.1±0.04 pM。二次LSPR检测则利用循环荧光探针裂解方法（CFPC）。当荧光DNA探针与靶序列杂交后，限制性核酸内切酶可作用于探针的AP标记位点，从而将长DNA探针剪切成两条短链。在局部等离子体光热场的作用下，剪切后的荧光基团在目标序列上解螺旋并发出荧光信号。这些循环释放的荧光探针可以刺激瞬时和累积的LSPR响应，从而将检出限LOD降低至0.275±0.051 fM。
首先，借助等离子体光热，可以对传感器表面进行精确的温度调控（图2）。通过高效的吸收入射光能量，对局部范围内的介质进行加热。其纳米尺度的温度可以通过调节入射激光功率进行控制，从而使传感器芯片表面的生物分子，如核酸、内切酶等具有可调控的生物活性。此局部温度的优化和生物分子的结合解离皆可通过共光路干涉光的相位改变进行实时测量。实验显示，在不同的温度下，两互补的核酸序列既可以快速结合，也可以相互解螺旋脱离。因此通过原位的温度优化，可使核酸序列和内切酶在局部热场中有效工作。
图2. 等离子体光热场的表征与局部温度校准。
通过限制性内切酶与光热场的相互作用，可以在金颗粒传感界面实现CFPC扩增（图3）。首先，在激光的作用下，较长的DNA探针会与目标核酸序列结合，从而激活限制性内切酶。被内切酶截断的短核酸序列会在光热的作用下发生双螺旋解离。在解离瞬间，荧光信号在金颗粒附近激发LSPR相位改变，从而观测到瞬时相位跳跃。而在不间断的“结合-剪切-解离”（BCD）循环反应中累积的荧光信号亦可以不断提升LSPR的光学相位响应，此相位改变可以用于对已捕获的病毒核酸序列进行定量分析。
图3. LSPR原位传感荧光放大信号。
基于直接杂交检测和CFPC循环荧光探针裂解检测的双模式检测平台可针对SARS-CoV-2病毒非结构蛋白（Nsp-13）的核酸位点进行定量分析（图4）。通过实验比较可以验证，在低浓度范围内，基于扩增的CFPC检测方法优于直接杂交的无扩增检测方法。而相比之下，直接检测方法在分析高浓度样品时可以给出快速定量测试结果。在实际应用中，直接杂交检测和CFPC检测可以实现对同一样品的双模式自验证测试，从而提供更可靠的病毒生物传感结果。与常规PCR方法相比，TP-DMT生物传感系统可以在30分钟内提供两次敏感读数。与其他电化学或光学SARS-CoV-2生物传感器相比，这种光热辅助的双模式检测系统可以在单个AuNI芯片上对同一样品执行“无扩增”和“扩增”两次相互验证的测试，从而实现更高的准确性和可靠性。
图4. 直接和CFPC检测病毒序列时的分析感测性能比较。
为了进一步验证TP-DMT传感概念，作者测试了来自患者的临床拭子样本，包括通过标准逆转录RT-PCR确定的COVID-19阳性和阴性样本。对于每个患者样品，作者进行了直接杂交检测和CFPC扩增检测的TP-DMT分析（图5）。在分析具有典型病毒载量的阳性样品时，直接杂交检测能够提供可靠的病毒生物传感结果。而在检测具有较低病毒载量的临床样品时，CFPC传感方法可以提供更为确信的阳性结果。
图5. 使用COVID-19患者样品进行TP-DMT生物传感验证。
综上所述，结合了光热辅助等离子传感技术的TP-DMT生物传感方法，可在不同浓度水平下实现病毒核酸物质的快速检测。特别是对于带有少量病毒的样品，这种双模式检测方法可以实现更低的检测限和更高的可靠性。在COVID-19新冠病毒疫情爆发和“后疫情”时代，此生物传感平台有潜力成为快速感染筛查和实时环境监测的工具，从而助力于恢复正常的生产和生活。
相关论文发表在[i,ACS Nano[/i, 上，苏黎世联邦理工学院的博士后研究员邱广宇为文章的第一作者，苏黎世联邦理工学院Jing Wang教授与苏黎世大学医院Gerd A. Kullak-Ublick教授为共同通讯作者。
Thermoplasmonic-Assisted Cyclic Cleavage Amplification for Self-Validating Plasmonic Detection of SARS-CoV-2
Guangyu Qiu] Zhibo Gai, Lanja Saleh, Jiukai Tang, Ting Gui, Gerd A. Kullak-Ublick*, and Jing Wang* |
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发表于 2021-3-31 11:18:20
